Інформація

Лабораторія біології пухлинної клітини

pogrebnoy-p-vЗав. лабораторії — Погрібний Петро Васильович

д.б.н., проф., персональна сторінка

Тел.

+38 (044) 259-01-88

E-mail

pogrebnoy@onconet.kiev.ua

Пріоритетні напрямки

  • Головним об'єктом досліджень групи є дефенсини — невеликі катіонні антимікробні пептиди, що є компонентами системи природженого імунітету, в цілому робота спрямована на встановлення ролі дефенсинів у канцерогенезі.

Ключові слова

дефенсини, проліферація, експресія, клітинний цикл, пухлини, антимікробна активність

 

Дослідження

Головним об'єктом досліджень лабораторії є дефенсини — невеликі катіонні антимікробні пептиди, що є компонентами системи природженого імунітету, в цілому робота спрямована на встановлення ролі дефенсинів у канцерогенезі. Дослідження проводяться методами ЗТ-ПЛР, Вестерн-блот аналіза, ІФА та імуногістохімічного аналіза з використанням систем in vitro та in vivo, а також на клінічному матеріалі (зразках хірургічно виділених пухлин людини та сироватці крові онкологічних хворих).

  • Дослідження іn vitro

Перші дослідження, що було проведено у відділі, було виконано на нативному hBD-2, що було ізольовано з культурального середовища клітин сублінії А431/1522. Нами було встановлено, що продукція hBD-2 in vitro є мітоген-залежною, а сам пептид може впливати на активність ряду мембранних та цитозольних кіназ, що вказувало на наявність у нього сигнальних функцій. В 1997-2000 було встановлено, що дефенсин може впливати на ріст та проліферацію епітеліальних клітин in vitro, та викликати їх лізис за високих концентрацій. Наші дані, що було отримано з використанням рекомбінантного hBD-2, заклонованого в плазміді pGEX-2T у вигляді злитого білка hBD-2-GST, підтвердили результати щодо концентраційно-залежної дії hBD-2 на проліферацію культивованих клітин in vitro.

Щоби знайти відповідь на питання, які функції може виконувати hBD-2 в злоякісно трансформованих клітинах, нами було створено клітинні лінії з регульованою експресією hBD-2: на базі ембріональних клітин нирки людини лінії HEK293 було отримано стабільну клітинну сублінію T-rex HEK-hBD2-m, що експресує біологічно активний hBD-2 за умови наявності тетрацикліну у культуральному середовищі клітин. Як було показано, експресія hBD-2 в клітинах сублінії T-rex HEK-HBD2-m призводить до специфічних біологічних ефектів, а саме до втрати колонієутворюючої активності та до зниження проліферації клітин.

Для дослідження особливостей клітин, що екс пресують бета-дефенсин-2, в моделі in vivo, нами було створено експериментальні моделі на основі клітин карциноми легені Льюїс (3LL), трансфікованих векторами, що кодують ген бета-дефенсина-2 миші; дослідження in vivo експериментальних пухлин, що походять з цих клітин, продемонструвало, що існує зворотня кореляція між швидкістю роста пухлин 3LL та рівнем експресії мРНК mRNA. Таким чином, результати досліджень in vitro та in vivo вказують на потенційну суп ресорну роль експресії бета-дефенсина-2 в пухлинних клітинах.

  • Дослідження іn vivo

Беручи до уваги дані публікацій щодо наявності у дефенсинів властивостей ад'ювантів та хемотактиків, нами проведено дослідження, спрямовані на створення протипухлинних вакцин, що містять дефенсини в якості імуномодулюючого компонента. З використанням експериментальної пухлинної моделі (карцинома легені миші) нами було проаналізовано ефективність застосування ДНК-вакцини на базі кДНК бета-дефенсина-2 миші (mBD-2), злитого з пухлино-асоційованим антигеном муцином-1 (Muc1).

Наші дані продемонстрували помірний антиметастатичний ефект вакцинації з застосуванням mBD-2-Muc1-ДНК-вакцини, що може бути значно підсиленим при одночасному введенні експериментальним тваринам вітаміна D3. Нами показано, що вітамін D3 активує експресію гена mBD-2 in vitro та in vivo, і висунуто припущення, що антиметастатичний ефект вакцинації в комбінації з вітаміном D3 може бути опосередкованим певною мірою активацією експресії дефенсина в клітинах легені миші.

  • Експресія hBDs в пухлинах людини і детекція в сироватці крові онкологічних хворих

Останні декілька років ми аналізуємо особливості експресії мРНК дефенсинів та продукцію hBDs в пухлинах людини: в пухлинах шийки матки і вульви (2001-2005), пухлинах ендометрія (2003-2004), пухлинах стравоходу і шлунка (2005), новоутвореннях легені (2006-2010), меланоми (2010-надалі). Паралельно проводиться забір крові онкологічних хворих, та розробляється та апробується методика виявлення hBDs в сироватці крові. Отримані нами результати в цілому свідчать про гіперекспресію бета-дефенсина-2 в карциномах людини незалежно від їх локалізації.

  • Дослідження механізму дії hBD-2

Нами було встановлено, що in vitro hBD-2 може діяти в наномолярних концентраціях як регулятор клітинного циклу і блокує клітинний цикл у точці звірки G1/S шляхом активації білка ретинобластоми та пригнічення експресії цикліну D1. Подібні ефекти спостерігали при дії hBD-2 на культивовані клітини меланоми та раку щитоподібної залози людини.

  • Отримання рекомбінантних hBDs, клонованих в pGEX-2T у вигляді злитих білків hBD-GST

В 2012 році нами було отримано рекомбінантні hBD-4 та hBD-3.

В 2013 р. нами було експресовано в бактеріях рек-hBD-4 у вигляді злитого білка GST-hBD-4. Аналіз активності рек-hBD-4 in vitro продемонстрував, що цей дефенсин впливає на ріст злоякісних клітин у концентраційно-залежний спосіб. В концентрації 1-100 нM рек-hBD-4 значно стимулює проліферацію та життєздатність клітин, прогресію клітинного циклу у точці звірки G2/M, колоніє-утворюючу активність та рухливість клітин. При дії 500 нM рек-hBD-4 ефекти були зворотними: значне пригнічення проліферації та життєздатності клітин, блокування клітинного циклу у точці звірки G1/S, значне пригнічення рухливості клітин та їх колоніє-утворюючої активності.

В 2014 р. нами було експресовано рек-hBD-3 — біологічна активність цього дефенсина in vitro зараз вивчається.

Гранти
  • Проект «Катіонні антимікробні пептиди: особливості експресії в клітинах меланоми in vitro та in vivo», що входить до складу комплексної міждісциплінарної програми НАНУ «Фундаментальні основи молекулярних та клітинних біотехнологій» (№0110U005758, 2010-2014)
  • Проект «Дослідження транскрипційних програм регуляції експресії генів в нормальних та злоякісно трансформованих клітинах» Грант НАН України № 0112U002194, 2012-2016
Конференції
Публікації

Вибрані публікації

  1. T. Shestakova, E. Zhuravel, L. Bolgova, O. Alekseenko, M. Soldatkina, P. Pogrebnoy. Expression of human beta-defensins-1-4 in human lung tumors: a pilot study. Exp Oncol 2008; 30 (2): 153-156.
  2. E. Zhuravel, T. Shestakova, N. Glushko, M. Soldatkina, P. Pogrebnoy. Expression patterns of murine beta-defensin-2 mRNA in Lewis lung carcinoma cells in vitro and in vivo. Exp Oncol 2008; 30 (3): 206-211.
  3. Zhuravel E, Efanova O, Shestakova T, Glushko N, Mezhuev O, Soldatkina M, Pogrebnoy P. Administration of vitamin D3 improves antimetastatic efficacy of cancer vaccine therapy of Lewis lung carcinoma. Exp Oncol. 2010; 32 (1): 33-9.
  4. Shestakova T, Zhuravel E, Bolgova L, Zaitsev S, Efanova O, Soldatkina M, Pogrebnoy P. Immunohistochemical analysis of beta-defensin-2 expression in human lung tumors. Exp Oncol. 2010; 32(4): 273-6.
  5. E. Zhuravel, T. Shestakova, O. Efanova, Yu. Yusefovich, D. Lytvin, M. Soldatkina, P. Pogrebnoy. Human beta-defensin-2 controls cell cycle in malignant epithelial cells: in vitro study. Exp Oncol 2011; т.33, №3, с.114-121.
  6. O.L. Gerashchenko, E.V. Zhuravel, et al. Biologic activities of recombinant human-beta-defensin-4 toward cultured human cancer cells. Exp Oncol 2013; 35(2), p.84-91.
  7. O. Gerashchenko, E. Zhuravel, O. Skachkova, N. Khranovska, V. Pushkarev, P. Pogrebnoy, M. Soldatkina. Involvement of human beta-defensin-2 in regulation of malignant potential of cultured human melanoma cells. Exp Oncol 2014; 36 (1): 17-23.
Патенти
Інновації
Співпраця
  • Інститут хімічної біології і фундаментальної медицини Сибірського відділення РАН (Росія)
  • Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка, Київ
  • Інститут біохімії ім Палладіна НАНУ, Київ
  • Інститут молекулярної біології та генетики НАНУ, Київ
Нагороди
Кадри
  • Марія Солдаткіна, к.б.н., старший науковий спвробітник
  • Олена Журавель, к.б.н., старший науковий співробітник
  • Тетяна Шестакова, к.б.н., інженер. В 2013 р. захистила кандидатську дисертацію за спеціальністю «онкологія» «Роль β-дефенсинаn-2 в регуляції проліферації клітин раку легені людини»
  • Наталья Глушко, інженер
  • Ольга Геращенко, інженер
  • Василина Ковальчук, інженер
  • Оксана Бойдуник, інженер
Історія
193 | 2017-01-13  4082
FaLang translation system by Faboba